2016年9月至2017年3月，我在美国进行了为期6个月的学习交流，与美国佐治亚大学纳米科学工程研究中心、复杂碳水化合物研究中心(CCRC)、联邦能源部生物科学研究中心(BESC)建立了深厚的合作关系。今年7月20-25日，我们将与佐治亚大学开展双边学术会议，由CCRC所长带队，6位顶尖专家组成，交流细胞壁相关最新研究进展。访学期间，除了学习国际上现金的单分子识别成像技术、糖组分析技术、免疫荧光抗体标记技术外，我还在J Plant Biochem Physiol（影响因子3.21）上，以通讯作者身份，发表SCI论文一篇。
我访学的佐治亚大学University of Georgia，简称UGA，位于美国东南小镇Athens，中文名雅典，距离州府亚特兰大90公里远。提到亚特兰大，首先让人想到他是1996年奥运会的申办地，其次，是Gone with the Wind《飘》的发生地，除此，还号称是全美十大富豪聚集地、最迷人的城市之一，达美航空公司、可口可乐公司总部、CNN总部都设在此。
被冠名全美最大的大学城之一的Athens，有着典型的美国乡村风情，这里的人平和友善。举个简单的例子，走在路上，总会有陌生人亲切的和你say hello；上校车，开校车的学生，就会say good morning，下车时，坐车的人会向学生司机say thank you，have a good day；在实验室，大家会互相问候how are you?
UGA始创于1785年，是全美第一所公立大学，也是美国公立常春藤名校之一。首任校长曾参与起草、签署美国《独立宣言》。14个学院，3.3万学生，2016年全美综合排名21，其中生物与农业工程研究生专业排名12、本科专业排名13。2016年里约奥运会上，UGA拿了十枚奖牌，有媒体统计，如果UGA可以作为一个主权国的话，其在奥运奖牌榜上的排名紧随巴西之后，位列14名。虽然是公立学校，但学校的发展很大程度上依赖个人捐款，仅2016年，UGA筹集的捐款就达到$183.3milliion，学校有近20%的学生受益于这些捐款带来的奖学金资助。
我此次访学主要在复杂碳水化合物研究中心CCRC和纳米科学工程研究中心，完成我的博士课题。续基因组学、蛋白质组学、代谢组学之后，由于动物多糖与很多人类疾病息息相关，植物多糖参与了植物生长发育的各个过程，因而新兴的糖组学研究已成为国际植物学的热点研究方向，而在美国糖组学领域最出名的当属CCRC。CCRC是1986年由美国联邦能源部投资在UGA创建，以研究植物、微生物、动物的复杂碳水化合物的结构、功能及其在植物生长发育、宿主病原微生物互作过程中的作用的研究所。一共有18个多学科交叉组，其中植物口有6个组，包括创始人Peter、现任所长Alan、我的两个导师Dr. Michael Hahn、Dr. Debra Mohnen，他们同时隶属美国联邦能源部生物能源科学研究中心BESC。BESC和我们课题组的研究目标一样，通过研究次生壁生物合成、结构修饰，以提高生物能源作物在生物能源生产上的应用价值。如我们所知，联邦能源部2007年斥资3.75亿美金成立了三大研究所，加州大学伯克利分校牵头的Jiont BioEnergy Institute，威斯康辛麦迪逊分校牵头的Great lake Bioenergy Research Center，以及橡树岭国家重点实验室牵头的BioEnergy Science Center，也就是BESC。2011年，彭老师和张校长带队，还有曹院长一起，走访了前两大研究所。5年后，我很有幸来到第三个生物能源研究中心BESC，深入了解见识美国以植物细胞壁领域专家牵头的生物能源研究是如何开展。当然我选择这里，还有一个很重要的原因，是因为Dr. Debra Mohnen，她在果胶质研究领域拥有较高的国际声望，现在是BESC的执行主席，09年高登Gordon国际植物细胞壁会议的主席，Gordon conference号称是学术界的华山论剑；另一个原因是Dr. Bingqian Xu，徐老师也是位传奇人物，39岁放弃宝鸡文理学院的副教授身份出国，43岁在Arizona state of Univ拿了博士学位，45岁拿到UGA的助理教授职位，十年的时间就做到教授职位，他率先开发了世界现已普遍采用的扫描探针显微镜SPM破缺结技术，发了Science、Nat Chem，又把国际化学、物理学领域最有影响力的刊物J Am Chem Soc, Phys Chem Chem Phys, Biotechnol Biofuels等统统发了几遍，当之无愧是世界单分子领域的权威。原因三，是Dr. Michael Hahn实验室“高大上”的糖组分析技术和全球收罗的多糖单克隆抗体库，现在细胞壁结构功能研究相关的高水平论文，很多都用到了这两项免疫学技术，所以他的合作非常广泛。Michael是最早一批被联邦能源部招募到CCRC的功勋人物，和前两任所长一样都是CCRC的奠基者。因为这些，我在UGA有了三个导师，经历了三个截然不同的实验室。
另外，我此次访学，还非常有幸地结识了一位非常专业的实验技术员。一位是还有充满艺术气息的Dr. Stefan Eberhard，瑞士人，做事非常严谨，但为人很幽默很亲和。他的扫描电镜图，在CCRC的楼道里、展示屏上随处可见，很多专业杂志、甚至是媒体报纸上，都会以封面形式，刊登他的作品。我全套免疫荧光抗体染色技术都是跟Stefan学习的。其实在CCRC有非常多这样优秀的实验技术员，例如：Dr. Malcolm ONeill，虽然是技术员，但在果胶RGI、RGII的结构、生化分析方面技术非常专业，所以和其他PI一样，他有自己的办公室，每天都可以看到他来此不疲的最早来实验室做实验（我做树脂包埋时，和他在一个实验室）。还有小Siva，印度人，非常能干、非常负责，Michael实验负责糖组分析前期分步提取的小管家，Michael因为自主研发了一套高通量的糖组分析仪（小机器人）和丰富的抗体库，所以全球有很多课题组都在寻求与他合作项目，他以前的经费非常充裕，所以组里最多的时候会聘请二十多个本科生来完成糖组分步提取的制样工作，而Siva就负责协助他指导这些本科生，督促项目运行。
Michael的糖组机器人，可以高通量地完成繁琐的酶联免疫反应(ELISA)，减少人工操作抗体吸附、洗板、显色测定等步骤带来人为误差。以我的实验材料为例，一共88个样品*2个重复*152个抗体=26752个ELISA反应，这2万多个ELISA反应机器人只需要12个小时就可以完成。但由于前期的制样过程还需要手动完成，所以整个糖组分析，目前只能说是半高通量。Michael的另一套核心技术是免疫荧光抗体染色技术，这套技术以前都是由他的博后Utku来负责，但由于Utku已离组，现在组里几乎已经没有人在用这套技术，所幸Stefan很多年前还做过一些这样的工作，我还能传承一些精髓。当然，我也“因祸得福”，可以完全独立的操作免疫荧光抗体染色全套设备，特别是那套先进的半薄切片机，这套切片机最核心的就是这个瑞士产的钻石刀，价值1万多美金。这把精贵的钻石刀和切片机，以前只有Utku可以使用。Michael实验室要求免疫荧光染色的切片必须达到250nm，也就是0.25um（我们常规石蜡切片是8um，振动切片是30-100um。在光线折射下，均一的250nm薄片呈现漂亮的鹅黄色。由于切片太薄，只能用眼睫毛收集，转移到载玻片上，在进行荧光染色），才能保证荧光染色的均一性和可重复性，同时植物组织，例如茎秆从上到下都处在不同的生长发育期，切片薄，可以保证我连续切出的几十个片子都处在同一个发育水平，再用上不同的抗体进行染色，实现原位表征。所以我刚去Michael实验，看到他们同一个材料，不同抗体染色的切片图，结构都是一模一样，仅仅是荧光强度的差别，很是惊讶，后来才知道诀窍就在于此。而且Michael实验室的这套技术，虽然包埋切片制片过程，很费时费力，特别是切片技术绝对是个技术活儿，我利用其它实验的零碎时间，前前后后切了一个多月才完成26个材料的切片工作，但这套技术熟练后，我可以实现一天一次性完成320个切片的荧光染色，这样可以大大保证材料的一致性和可比性。
徐老师的实验平台有两个核心武器，一个是隧道扫描显微镜STM，与此相关的实验技术在1986年获得过诺贝尔物理学奖，徐老师2003年也因为相关技术的突破，发表了Science，另一个就是原子力显微镜AFM，可以在纳米水平高分辨率成像，原位探测多糖的表面形貌，并且可以在液体中观察样品，模拟样品的自然生理条件。虽然现在AFM仪器很多，我们学校也有两台，型号还很新，但是能做单分子识别的，在全世界只有几家，徐老师在这方面可以说是当之无愧的权威。这张图展示的是我去徐老师实验室一个月后，扫的水稻茎秆切片经8%亚氯酸钠处理后的纤维素形貌图，这里要非常感谢张冉的无私帮助和指导，大大缩短了常规三个月才能上机操作的入门期，当然这也要感谢徐老师考虑我此次“时间段任务重”的访学特性开了绿灯。
众所周知，细胞壁决定了植物的形态、结构、机械强度。了解细胞壁的基本结构对于将细胞壁多糖转化成发酵单糖，并用于生物能源相关生产，具有非常重要的作用。我们已知很多多糖合成修饰基因都参与影响植物细胞壁的完整性以及生物质酶解转化效率，但有关果胶甲酯酶基因在这方面的作用，还尚不明晰。所以，我的博士课题就是采用免疫学、塘组学、化学分析、单分子识别成像技术手段，以拟南芥果胶甲酯酶突变体和超表达转基因植株为研究对象，探讨果胶同聚半乳糖醛酸HG的甲酯化程度对于拟南芥细胞壁酶解转化效率的影响。
糖组学分析，主要是先通过分步提取细胞壁多糖组分，再运用155种不同多糖表位的单克隆抗体，依托酶联免疫吸附实验，高通量的分析各类细胞壁突变体结构，表征细胞壁生物合成基因功能，还可以从中筛选适合免疫荧光标记的抗体。Michael实验室免疫荧光标记技术的亮点之处，就在于可以实现原位表征各种时期的细胞壁结构成分。Debra实验室的谭老师有很好的糖化学研究基础，他的HPLC系统对于中性糖、酸性糖（半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸）的分离度非常好。在谭老师的指导下，我们用了最新发表的一个方法，可以快速、同步定量测定果胶的甲酯化、乙酰化。AFM单分子识别成像技术的核心，一个是要实现高分辨率，另一个是通过识别来弥补AFM缺少的化学特性。我在CCRC和徐老师实验室的研究目标主要通过上述技术，表征拟南芥PME突变体和超表达转基因植株，我们的假设是PME突变体果胶HG的甲酯化程度升高，超表达转基因植株甲酯化程度降低。实验材料信息如下，这是突变体的组织表达图谱，2个突变体在茎秆、叶片、下胚轴的表达量相对较高；这是突变体、超表达转基因植株的表达量分析结果，从中选取了表达量显著升高的转基因材料，带去美国进行相关实验。
实验内容，主要是取5周或8周的拟南芥茎秆、莲座叶，分别制乙醇不溶物AIR，也就是biomass，在经过草酸铵、碳酸钠、1M KOH、4M KOH、Chlorite、再4M KOH分部提取，获得的提取液，经中和、透析、冻干制成样品，再按要求稀释到规定的糖浓度，就可以用糖组机器人完成糖组分析。分步提取过程中，草酸铵和碳酸钠主要提取的是果胶质，1M KOH和4M KOH主要提取的是半纤维素，Chlorite主要提取的是木质素，最后一步4M KOH主要提取与纤维素紧密交联的半纤维素和果胶质。糖组制得的样品可以同时用于AFM观测，以及中性糖、酸性糖、甲酯化程度等化学分析。并选取了与果胶HG的甲酯化相关的抗体，分别对突变体、转基因材料的根、下胚轴、茎、叶，进行了免疫组化细胞学实验。时间安排，总共25周，CCRC和徐老师实验室两边穿插进行。
结果如下：
1、从糖谱热图可以看出，与野生型相比，Atpme1的果胶低甲酯化HG的抗体结合信号显著降低，但高甲酯化的信号增高不是非常明显，同时，其他多糖表位也有变化，但不同提取组分的抗体结合信号变化趋势不具有一致性。Atpme26与Atpme1的pattern不同，果胶高甲酯化HG的抗体结合信号显著升高，但低甲酯化的信号也有增高，同时出乎意料的是，7种类型的Xylan抗体，均显示Atpme26的多糖结合信号增强。从糖谱曲线图可以看出，不同组织部位的不同提取组分的荧光强度有差异，但趋势基本一致。
2、免疫抗体荧光标记。我把所有与果胶HG甲酯化程度相关的抗体（共有20种）全部测试了一遍，结果显示，并不是所有相关抗体都可以用于材料对比，所以 从中精选了6个抗体进行试验。前4个抗体标记低甲酯化的HG，后2个标记高甲酯化。从此图可以看出，在Atpme26叶片切片低甲酯化显著降低，高甲酯化显著升高，JIM7抗体信号差异不明显；在Atpme26茎秆切片低甲酯化显著降低，高甲酯化差异不明显；在Atpme1根部切片低甲酯化显著降低，高甲酯化对比不显著；结果很多，这里不累述，详细信息我在稍后的开题报告中，再向大家阐述。
3、化学分析。
这部分是最后一个月开始做，因为需要重新制样，又要对新方法摸索实验条件，时间完全不够用。本来回国最后一周还准备大干一场，战斗到最后一刻，结果谭老师家里、徐老师实验室、我美国房子退租相继出状况，最后只好带着未完成的遗憾回国了。
这部分还没有完成，后续还需要跟CCRC继续合作完成。这部分重点是验证材料的果胶甲酯化变化情况。甲酯化程度用以下这个算式进行运算得到，所以，需要分别用HPLC测定GalA含量，用NMR测定Methanol含量。这是GalA的运算结果，HPLC峰图还在谭老师的电脑里，突变体较野生型的甲酯化程度降低，超表达转基因较野生型升高。NMR测定了AIR和AO提取物的Methanol含量，突变体较野生型提高。
4、AFM单分子成像。这里简单回顾一下，AFM的原理，它是利用极尖细的探针（针尖小于10 nm，由几个原子组成），与样品表面原子在很短的距离（0.2nm-10nm），发生相互作用力（主要是范德华力），像盲人摸象一样，获得材料表面的三维纳米尺度成像。刚刚提到徐老师实验室有两台核心武器，STM分辨率高，但只限于导电样品，而对于像多糖这样的非导电样品，就需要采用AFM，而且AFM还有一点优势是，可以在液体中观察样品，模拟样品的自然生理条件。这张图显示的是果胶提取物在mica上呈现的形态，果胶质呈多分支态，单线宽度约0.5nm，长度60nm-1.2um，在线性末端或线性交联处，还清晰可见“线团状”聚集体。已有文献（Pose(2015)的文献，供参考，其经CDTA提取果胶质链长度84-101nm，多呈单线性）显示，果胶多糖为柔性状态，很多文献还使用特殊的处理方法，以使果胶分子自然伸展，以便测量。而我们的形貌图显示，按照糖谱制样方法获得的果胶多糖，延展性也很好，如果结果可以重复的话，很利于后续做识别，甚至是互作。
关于实验管理，我在CCRC有几点体会可以与大家分享：
1、资源高效整合。
（1）学科交叉的集聚地。这里涵盖植物学、动物学、微生物学、化学、物理学、免疫学、结构学、生物分子模拟等多个学科专家，学科交叉合作频繁，通过良好的内部合作和外部互作，因而拥有雄厚的科研经费。而且科研资源整合地非常好，整个实验大楼的各个房间从不锁门，所有仪器设备全部实现共享，大型仪器设在专门的Service平台，由平台经理负责，管理队伍多达二十余人，为所内所外甚至全球，提供测试服务。
（2）空间资源的合理利用。CCRC每个PI，人均大概只有1间10平米的办公室、1间50平米左右的实验室、1间植物培养室，但共享空间却很充裕。以CCRC的餐厅为例，这里都打造成集就餐、厨房、会议、供货商设备展示、研究生活动于一体的多功能平台，餐厅还直接可以通往研究中心背后的小森林，午间时分，经常可以看到研究生或本科生，在此交谈课题。楼道间，到处设有沙发位，供大家讨论交流。
2、学术气息浓厚。
（1）家的氛围。圣诞节实验室会装饰一新；Dr. Maor喜欢打赤脚在办公室到处走；餐桌旁，会有白糖、餐厅纸供大家随时取用。
（2）学术氛围。PI办公室门外会放书架，堆上经典的专业书籍供学术借阅；餐桌上会放有最新的权威学术刊物，Nature、Science、Cell随时供你享受大餐，方便大家累得时候聊一挂最新的学术动向；York的办公室门口挂满爱因斯特各个时期的个性画像，你可以猜猜这位PI到底是有多爱这位“男神”。
3、安全管理。
（1）门卡管理。在美国出门，你身上可以只踹20美元，但一定要带两张卡，一张是信用卡，一张是UGA卡。UGACard类似我们的一卡通，但用处非常大。举例，一卡在手，可以畅游整个UGA、Athens的各个角落，因为所有的校车、城市公交，都对UGACared持有者免费。同时，最重要的是，持有授权后的UGACared，你才能在每天早8点前、下午5点后，以及周末进出实验大楼。也就是说实验大楼只在上班时间，对所有人开放，下班时间必须刷卡进出。
（2）资格认证。进实验室第一件事，考取两个有关废弃物处理的资格证书。所有内容在线上完成，考试通过后，打印证书交给PI，你才有资格做实验。
（3）资料齐全。每个实验室都要求将SDS手册放在最醒目的地方，SDS手册里有实验室所有毒有害试剂的毒性相关信息和预防措施，这些信息由试剂供货提供，但要求每个实验室负责人将毒害信息，向实验室内所有研究人员公开。
（4）废弃物管理严格。所有玻璃、尖锐物，必须丢入纸盒垃圾桶，如果有人没做到，卫生阿姨会来找你麻烦。所有试剂用多少配多少，不允许多配，实在用不完的试剂，必须转入废弃瓶中，标示清楚后，放入废弃物存放点(Satellite Accumulation Area)，通知或等待学校专人上门回收。
（5）警示醒目。电梯旁的EMERGENCY提示牌，会告知处理飓风、火灾、化学品泄露，甚至是枪击事故的紧急应对方法。实验室大门上贴满了危险品存放情况、安全须知、紧急电话、危险品登记标示说明之类的警示牌，尽一切可能提醒实验室成员，实验室第一，个人防护第一。
6个月的时间，说长不长，说短也不短，有过伤心流泪，但更多的是甜美回忆。记得去年出国前联系去Debra实验室，她提了一大堆“刁钻”的问题让我回答，当时不理解，后来我才明白，那是因为我是她实验室的第一个访问学者，所以离别前，当她说她很幸运有我能来实验室，我很满足。这些甜美的回忆，来源于UGA那些可爱的导师、学生、邻居，甚至路人们，我要感谢他们，但更要感谢是我在华农的团队成员们，在我短暂离开期间的帮助、理解和支持！希望我的收获，能成为团队成员们的共同收获。
